1. 血清:使用不含热原和内毒素的试管,操作过程中避免任何细胞刺激,收集血液后,3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2. 血浆:EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。
3. 细胞上清液:3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4. 组织匀浆:将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。
关于血清样本注意事项:
大部分ELISA检测均以血清为标本。血清标本可按常规方法采集,应注意避免溶血,红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质,以HRP未标记的ELISA测定中,溶血标本可能会增加非特异显色。此外还应避免细菌污染,因为菌体中可能含有内源性HRP,也会产生假阳性反应。血清标本宜在新鲜时检测。如在冰箱中保存过久,其中的可发生聚合,在间接法ELISA中可使本底加深。
血清的采集、处理以及保存如下:
① 真空采集新鲜血液,加入无菌试管中;
② 采血后室温静置1小时;
③ 将采集血液用离心机4℃,2500rpm离心10分钟;
④ 取上清,分装冻存备用(24小时内检测存于2-8℃;1个月内检测存于-20℃;长期检测可存于-80℃,可放置保存6个月)。
样本应避免反复冻融,在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
检测原理:试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被肾素(Renin)抗体的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的肾素(Renin)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值),计算样品浓度。
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